根管消毒材料对牙源性干细胞的作用研究进展

    2004年，Banchs等首次对牙髓坏死的年轻恒牙采用一种新的治疗方法，在大量化学药物冲洗、抗生素糊剂封药控制根管系统炎症后，刺破根尖周组织引起出血，使用矿物三氧化物凝聚体（MTA）冠方封闭，最终根管壁和根尖部不断沉积硬组织，达到牙根继续发育、根尖孔闭合及管腔缩小的治疗目的，这种治疗方法被称为再生性牙髓治疗（regenerative endodontic treatment，RET），也称为“牙髓血管再生治疗”，是治疗年轻恒牙牙髓病和根尖周病的一种新选择。
    近年来，诸多学者通过动物实验和细胞学实验探索RET使牙根继续发育的具体机制，目前认为RET中多种牙源性干细胞参与组织再生与修复，血液中的生长因子促进干细胞增殖分化，血凝块为干细胞的聚集提供基质和支架。RET中根管消毒的作用不容忽视，彻底的根管消毒是进行下一步治疗的前提。有研究表明，RET失败的主要原因是根管清创不彻底，根管内仍存在着较为完整的细菌生物膜，在刺破根尖组织出血后，残留的细菌得到充分营养物质，便可大量繁殖，导致治疗失败。有学者认为，如果为了清除侵入牙本质小管内的细菌，在RET中进行机械清创也是必要的，此时控制根管内感染比保留牙本质壁更重要，并提出应当重新评估根管消毒的重要性以确保RET的成功。
    RET中干细胞及根管消毒的作用毋庸置疑，近年来随着学者们对牙源性干细胞认识的不断加深，根管消毒材料对牙源性干细胞的作用逐渐受到关注。
    1.根管消毒在年轻恒牙RET中的作用
    牙髓炎症是一把双刃剑。早期轻度的炎症反应会刺激受损组织释放信号因子，例如基质细胞衍生因子，引起干细胞归巢，从而使大量干细胞聚集在受损部位，启动组织的自我修复功能，若缺乏炎症阶段，组织的自我修复功能则无法启动。研究发现，在肿瘤坏死因子（TNF）-α和白介素（IL）-1β作用于牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）3d后，促进DPSCs的增殖，并能诱导矿化相关因子骨钙素、骨涎蛋白、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白1的表达，而在7、12d时DPSCs的增殖受到抑制，牙本质中非胶原蛋白的基因表达下降，这一结果充分说明了炎症的双重影响。
    如果早期阶段的炎症未得到及时有效的控制，就会转化为牙髓慢性炎症，导致组织损伤，最终发展为根尖周炎。而晚期重度的炎症会使干细胞长期暴露于炎症信号分子（如TNF-α、IL-1和IL-6等）中，从而破坏干细胞微环境，干扰干细胞的增殖、分化能力，甚至引起干细胞凋亡，最终导致牙根发育停止。然而，由炎症导致的牙根发育停止并不是永久性的，在彻底的根管清创和根管消毒后可使牙根继续发育、根尖孔闭合。
    早在2001年就有学者对根尖周炎伴有瘘孔的年轻恒牙进行大量的化学药物冲洗根管及根管封药后，观察到根管壁增厚、根尖孔闭合。目前，临床上主要通过机械预备和根管消毒来控制根管内感染。机械预备因其会使牙本质壁变薄，降低牙根抗折力而饱受争议，因此RET中通常采用大量化学药物冲洗和根管封药来控制感染。
    研究表明，干细胞只有在其特殊的微环境中才能保存干细胞特性，即在相应信号分子刺激下分化为成牙本质细胞、成牙骨质细胞等，控制牙髓感染后会使干细胞微环境得以恢复，同时，有效的根管消毒是组织再生中募集干细胞的前提。因此，从根管消毒材料的抗菌性及对干细胞活性的影响来讲，两种或两种以上的感染控制方法相结合使用是未来的发展趋势。
    2.年轻恒牙RET中的根管消毒材料
    临床上最常用的根管消毒材料包括氢氧化钙（calcium hydroxide，CH）和抗生素糊剂，其中抗生素糊剂有由甲硝唑、环丙沙星、米诺环素调拌而成的三联抗生素糊剂（triple antibiotic paste，TAP）、由甲硝唑、环丙沙星调拌而成的二联抗生素糊剂（double antibiotic paste，DAP）以及将米诺环素更换为头孢克洛的改良三联抗生素糊剂（modified triple antibiotic paste，mTAP）、Augmentin等。CH用于根管消毒，其良好的抗菌性主要依赖于高pH值（10~12），持续而缓慢释放的OH-能够破坏细胞胞浆膜，中和细菌产生的各种酶类和蛋白质，灭活内毒素，破坏细菌DNA，从而达到抗菌目的。
    而抗生素糊剂自1996年由Hoshino等首次提出，并采用药敏试验及细菌复苏实验对TAP的抗菌性能进行研究，发现TAP浓度在20μg/mL和50μg/mL时，即可使细菌数量降为零。抗生素糊剂因其优秀的抗菌性能而成为RET治疗过程中根管消毒材料的首选。尽管CH及抗生素糊剂的抗菌作用明确，但仍有较多不足之处。CH存在易被炎性组织吸收、形成不规则钙化桥及破坏牙本质胶原纤维使牙根抗力减弱易导致根折等问题。而抗生素糊剂存在着使牙齿变色、诱导耐药菌株形成、发生过敏反应及降低牙本质机械性能等缺点。
    3.根管消毒材料对各种牙源性干细胞的影响
    RET是一种以生物学为基础，取代受损牙齿结构（包括牙本质、牙根和牙髓牙本质复合体）为目的的治疗技术。该项技术以干细胞为基础，依赖于组织工程三要素——干细胞、支架材料及信号分子。参与RET的牙源性干细胞主要有根尖牙乳头干细胞（stem cells from apicalpapilla，SCAP）、DPSCs、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），以及颌骨骨髓间充质干细胞。
    3.1根管消毒材料对SCAP的作用
    根尖牙乳头是牙根形成及发育的生长中心，与牙根发育关系最为密切。有学者将不同浓度（0.01~100mg/mL）的TAP、DAP、mTAP、Augmentin及CH与SCAP共培养3d后，进行台盼蓝活细胞染色，发现4种抗生素糊剂组的SCAP存活率随着浓度的升高而显著降低，低于0.1mg/mL时无明显毒性作用。而CH组中任何实验浓度对SCAP均无毒性作用，其中1mg/mL的CH反而能够显著提高SCAP的增殖率。有研究表明，低浓度的CH可促进转录因子的磷酸化，从而激活ERK信号通路中起关键作用的ERK1/2，调节相应基因的表达，促进干细胞增殖，并保护干细胞避免凋亡。
    3.2根管消毒材料对牙周膜细胞的作用
    目前根管消毒材料对PDLSCs的作用研究尚未见报道，但有针对牙周膜细胞（periodontal ligament fibroblasts cells，PDLCs）的相关报道。PDLCs直接来源于牙周组织，是多种细胞的统称，包括成纤维细胞、PDLSCs、成牙骨质细胞、上皮剩余、成骨细胞和破骨细胞，在特殊培养条件下可发生矿化、成骨，被视为牙周组织工程中的种子细胞。Yadlapati等利用TAP、DAP、米诺环素及CH4种材料的24h、48h浸提液处理PDLCs24h，进行细胞活力检测和炎症基因表达检测，结果显示：4种材料中TAP和米诺环素对PDLCs的毒性作用最强，差异有统计学意义，而DAP和CH组与阴性对照组的细胞活力差异并无统计学意义；炎症基因表达的检测结果除IL-6表达有明显提高外，IL-10、TNF、IL-8、IL-16、IL-1α、IL-1β的表达差异均无统计学意义。
    IL-6是一种炎症调节因子，作为促炎因子可激活B淋巴细胞，使其分化为浆细胞，分泌急性期炎症蛋白从而加速炎症进程；同时其亦可作为抗炎因子，拮抗TNF-α和IL-1的作用，并激活抗炎因子IL-10而进行炎症调节。根据以上实验结果，该研究者推测TAP对PDLCs的毒性作用及其使炎症因子IL-6表达提高可能与RET的失败有潜在关系，尤其是当根管消毒材料直接与根尖周组织直接接触时，毒性作用更明显。
    3.3根管消毒材料对DPSCs的作用
    DPSCs是最早发现的牙源性干细胞，有分化为牙髓-牙本质复合体结构的潜能。Labban等通过乳酸脱氢酶释放法与水溶性四唑盐法结合测定不同实验浓度的TAP、DAP及CH对DPSCs的影响，结果发现，低浓度的根管消毒材料（TAP<2.5mg/mL，DAP<0.3mg/mL，CH<5.0mg/mL）对DPSCs不但无毒性作用且能够明显促进DPSCs的增殖，而高于该浓度则表现出细胞毒性作用。另有学者采用不同浓度的TAP、DAP分别处理粪肠球菌建立的细菌生物膜及DPSCs3d，来研究不同浓度下TAP、DAP的抗菌性和细胞毒性，发现任何实验浓度（0.125~10.0mg/mL）的DAP、TAP对粪肠球菌均有较好的抗菌效果；当抗生素浓度为0.125mg/mL时DPSCs无明显毒性作用。
    以上两项实验所得结果略有差异可能是因所用细胞状态不同、检测方法敏感性因素造成的。适宜的根管消毒材料不仅可以对根管系统进行彻底的消毒，也可促进干细胞的增殖分化，为年轻恒牙牙根继续发育营造适宜的微环境。基于实验研究，2014年美国牙髓病学会（AAE）关于RET的操作指南中指明，使用抗生素进行根管消毒的推荐浓度为0.1~1.0mg/mL。若所使用的浓度超过该推荐浓度，干细胞可能会受到双重损害。一方面是根管消毒材料超出根尖孔后，会直接损害根尖周组织中的干细胞；另一方面，虽然在根管封药后会进行大量的药物冲洗，但根管壁内仍可能有消毒材料的残留，当RET刺破根尖出血后随血液进入到根管内的干细胞会受到残存于根管内消毒材料的影响。
    最近有报道将甲硝唑和环丙沙星按比例置入纳米纤维支架中形成一种新型制剂，可达到药物缓释、长期抗菌的作用，这种合成药物在24h达到最高释放量，并能够维持该浓度约14d。通过水溶性四唑盐法检测该剂型对DPSCs的作用发现，该剂型与普通的DAP相比能明显降低对DPSCs的毒性作用，同时也易于去除药物，以免对干细胞造成二次损害。
    4.小结
    综上，对于根管消毒特别是在年轻恒牙牙髓再生治疗中，需要辩证地看待，摒弃原有的观念，充分考虑到根管消毒材料对干细胞的双重影响，平衡利弊，寻找既可达到理想的消毒效果又不损伤干细胞的生物相容性好的根管消毒材料。